骨肉瘤(osteosarcoma,OS)屬于起源于間充質的一種惡性骨腫瘤,是兒童與青少年罹患原發性惡性骨腫瘤疾病譜中最常見的。骨肉瘤患者的年齡分布呈現雙峰狀態,分別為青春期人群與老年人群。青春期高峰集中在大約15歲。0~24歲組的骨肉瘤發病率為4.4/百萬。第二個峰值集中在75歲左右,主要由與佩吉特病或其他骨性病變相關的繼發性骨肉瘤組成。男性與女性的發病率之比為1.22:1。轉移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并發癥,約有80%的骨肉瘤患者在確診時發現已存在轉移性或微小轉移性病灶。由于治療原則和化學療法的進展,患者的5年生存率從不到30%提高到70%以上。

盡管有了上述進展,但骨肉瘤發生發展的生物學機制研究仍任重而道遠,如何從根源上治愈骨肉瘤是當今醫學界面臨的難題之一。整合素連接激酶相關磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一種絲氨酸/蘇氨酸(S/T)磷酸化酶,與細胞的生存和凋亡有關。ILKAP同時也是一種具有調控腫瘤發生發展功能的抑癌基因表達產物。ILKAP廣泛表達于人體組織中,主要在腎臟、骨骼肌、肝臟等臟器中表達水平較高。介導細胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。

ILKAP與腫瘤細胞的發生、發展息息相關。低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是腫瘤微環境與腫瘤病因學研究中的重點。作為一種轉錄因子,HIF-1有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失調,細胞將具備多種惡性能力并演變成腫瘤。早期研究認為,細胞在正常微環境下,HIF-1主要受羥化酶的調節而進入泛素降解途徑,而僅當細胞處于低氧條件時HIF-1不能被降解,進而發揮功能。近年來隨著對HIF-1調節方式的深入研究,人們發現羥化反應并不是HIF-1轉錄活性調節的途徑,磷酸化調節也是調控HIF-1的一種重要方式,尤其是在非低氧條件下。

研究目的:證實低氧可導致細胞發生凋亡；研究低氧條件下ILKAP通過與HIF-1α相互作用,對骨肉瘤細胞凋亡產生的相關影響。

研究方法:

1、細胞低氧模型的構建與監測:使用氣套式二氧化碳培養箱將骨肉瘤細胞進行培養。連續從0h至96h將氣罐中充入了混合的O_2(1%)與N_2(94%)和CO_2(5%)。

調節氣套式二氧化碳培養箱的溫度(37°C)、濕度(95%)。每24h更換細胞培養液。通過YSI模型55溶氧測定儀來監測培養箱內溶氧量,從而監測低氧環境。

2、骨肉瘤細胞活力測定:臺盼藍染色試驗測定細胞存活率。將單細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻。每0.1 mL單細胞懸液中加入一滴臺盼藍染液,室溫下染色3~5 min,記錄活細胞和死細胞數。將處理過的骨腫瘤細胞材料在高倍鏡下觀察。分別計數1000個細胞內的活細胞和死細胞數,統計未染色細胞,用公式計算細胞存活率。

3、骨肉瘤細胞凋亡檢測:本實驗采用激光共聚焦顯微鏡技術通過觀察骨肉瘤細胞內DAPI與TUNEL的共定位,判斷骨肉瘤細胞是否經歷凋亡。

4、檢測HIF-1α、細胞凋亡標記物:采用蛋白質免疫印跡(Western Blot)—底物化學發光ECL法。

5、研究ILKAP在導細胞凋亡過程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒轉染與Ad-ILKAP過表達的研究方法。6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之間的相互作用:對細胞進行了72h低氧處理,而后進行免疫共沉淀實驗。研究結果:1、細胞活力隨著時間延長而下降,細胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α隨低氧處理時間延長逐步被誘導,磷酸化HIF-1α逐漸減少。通過400U ILKAP處理HIF-1α,PBS作為陰性對照,400Uλ磷酸酶作為陽性對照,發現ILKAP和λ磷酸酶對于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐漸增多。2、低氧條件下細胞存活由ILKAP shRNA維持。低氧條件下細胞凋亡與ILKAP有關。

相同低氧時間下,ILKAP shRNA組的細胞凋亡數明顯少于對照組(P<0.05)。Western blot條帶顯示HIF-1α在ILKAP shRNA組與對照組比較,大部分沒有轉為去磷酸化形式。3、通過免疫共沉淀實驗發現,磷酸化形式的HIF-1α優先與抗ILKAP抗體免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α優先與p53抗體免疫共沉淀,ILKAP與p53之間沒有相互作用。4、相比于對照組,Ad-ILKAP組的細胞存活率顯著減少,呈時間依賴性(P<0.05)。細胞凋亡標記物和TUNEL法在Ad-ILKAP組相比于對照組,反映出顯著增加的細胞凋亡現象。常氧條件無法誘導HIF-1α表達,但在Ad-ILKAP組可檢測。

結論:1、細胞凋亡數量會隨著低氧處理時間延長而顯著增加。ILKAP可以起到類似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化狀態在持續的低氧誘導細胞凋亡過程中發生改變,ILKAP可使HIF-1α從磷酸化狀態轉為去磷酸化狀態。2、長時間低氧誘導情況下,下調細胞內ILKAP表達,則細胞凋亡減少。由此可見,ILKAP在長時間低氧誘導的細胞凋亡過程中發揮重要作用。3、ILKAP結合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后與去磷酸化形式的HIF-1α分離,去磷酸化的HIF-1α則與p53結合。ILKAP不與p53直接作用。4、常氧無法誘導HIF-1α表達。在常氧情況下,上調細胞內ILKAP表達可誘導細胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。綜上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且對后續p53依賴的細胞凋亡發揮重要作用。考慮到其與p53及p53本身的復雜作用,我們現階段的實驗結果為進一步研究不同HIF-1α類型在多種疾病中的作用基因奠定了基礎。